定量蛋白質組學的絕對定量方法需要使用標準 內標肽，內標肽的純度和穩定性等性質影響定量方 法的準確度和精確度。同時，蛋白質定量方法研究 中也需要保證蛋白質樣品的性質穩定和一致。由于 多肽及蛋白質的不穩定性在很大程度上影響蛋白質的定量研究，因此快速、有效地評價和表征樣品的穩 定性是定量蛋白質組學深入研究應該解決的問題之 一，樣品穩定性也是定量蛋白質組學研究必須關注 的基本內容。 血管緊張素 II 是人體內重要的體液調節物質，對心血管功能穩定、電解質和體液平衡的維持、血壓 調節等方面均有重要作用［1］。血管緊張素 II 作為 標準內標肽和藥用多肽時，其純度、穩定性是質量優 劣的關鍵指標。血管緊張素 II 的檢測多采用高效 液相色譜( HPLC) 結合免疫化學方法［2］或放射性同 位素檢測［3］。也有基于高效液相色譜法研究物理 和化學因素( 如保存條件、溫度、 pH 值、緩沖溶液) 對多肽穩定性的影響［4］。相比 HPLC，毛細管電泳 ( CE) 方法速度快，分辨率高，所需樣品量少，已有多 肽藥物［5］和生物樣品中血管緊張素及衍生物的分 析報道［6］，與毛細管電泳相關的毛細管電泳-質譜聯 用( CE-MS)［7 －9］、毛細管電色譜( CEC)［10］方法也出 現在一些多肽的分析中。 糖蛋白是生物體內重要的功能蛋白，也是修飾 蛋白質組學的研究熱點。作為定量蛋白質組學研究 的基礎，了解糖蛋白的穩定性是其相關研究的基礎 和前提。目前糖蛋白穩定性的研究重點主要是利用 分子動力學模擬和物理化學參數變化研究其結構穩 定性［11 －13］。也有基于紫外光譜法針對特定生物體 內所提取的蛋白質的含量變化進行穩定性表征的研 究報道［14］。利用毛細管電泳分析與糖有關的糖蛋 白、寡糖和糖肽已有綜述報道［15， 16］ 。 多肽和糖蛋白大多具有生物學活性，外界條件 變化易于影響多肽和糖蛋白的結構，引起穩定性改 變和分子的荷質比變化。毛細管電泳法可快速表征 多肽和糖蛋白的分子的荷質比差異。在不同的外界 條件下( 如樣品存放時間、溫度、溶液 pH) ，多肽和 糖蛋白的電泳圖譜的出峰個數、出峰時間以及峰形 等參數可指示分子的表面電荷性質甚至分子結構的 變化，從而可用于表征多肽和糖蛋白的穩定性。盡 管已有較多針對多肽和糖蛋白的相關分析報道，但 針對兩類樣品穩定性和影響因素的研究還沒有較系 統的報道。本文以市售血管緊張素 II 和植物血球 凝集素、牛凝血酶、人凝血酶、辣根過氧化物酶4 種 糖蛋白為多肽和糖蛋白模式分子，利用毛細管電泳 分析方法表征其穩定性。

1 實驗部分

1． 1 儀器與試劑 Beckman P/ACE MDQ 毛細管電泳系統，配備紫 外( UV) 檢測器( 美國 Beckman Coulter 公司) 。Agilent 7100 毛細管電泳系統，配備二極管陣列檢測器 ( DAD 檢測器) ( 美國 Agilent 公司) 。 血管緊張素 II( Ang II) 是人工合成的 DRVYIHPF 八肽， pI 6. 94，純度≥95%，購自上海強耀生物科技有限公司。植物血球凝集素( PHA，pI 5. 4 ～ 6. 5) 、牛凝血酶( B-Thr，pI 5 ～8) 購自 Sigma Aldrich 公司，人凝血酶( H-Thr，pI 5 ～8) 購自 Enzo Life Sciences 公司，辣根過氧化物酶( HRP，pI 3 ～ 9) 購自 ROCHE 公司。 硼酸、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、檸檬酸和檸檬酸 鈉( 北京化工廠) ，硼砂和磷酸氫二鈉( 國藥集團化 學試劑有限公司) ，磷酸氫二鈉( 北京化學試劑公 司) ，Tris( 北京拜爾迪生物技術有限公司) ，上述試 劑均為分析純，實驗用水均為蒸餾水。 熔融石英毛細管購自凱利奧拉色譜分析( 邯 鄲) 有限責任公司。涂層毛細管購自河北邯鄲開發 區奧泰克生物科技有限公司。

1． 2 毛細管電泳實驗條件 多肽分析條件: Beckman P/ACE MDQ 毛細管電 泳系統，進樣壓力3. 45 kPa( 0. 5 psi) ，進樣時間5 s; 正向20 kV 分離，檢測波長為 280 nm; 樣品溶液用 稀釋后的電泳緩沖液配制。熔融石英毛細管( 有效 長度/總長: 40 cm/50. 2 cm，內徑: 75 μm) ，兩次實 驗間和實驗結束后，依次用0. 1 mol/L NaOH 和H2O 在172. 37 kPa ( 25 psi) 下沖洗 5 min。毛細管不用 時需將兩端水封后置于室溫下保存。 糖蛋白分析條件: Agilent 7100 毛細管電泳系 統，進樣壓力 5 kPa，進樣時間 5 s; B-Thr 的分析電 壓為 －10 kV，其余3 種糖蛋白均為 －20 kV;檢測波 長為195 nm; 樣品溶液用 0. 2 mol/L( pH 7. 4) 硼酸 鹽緩沖液配制。涂層毛細管( 有效長度/總長: 25 cm/33. 5 cm，內徑:75 μm) ，新毛細管在使用前分別 用20 mmol/L H3PO4 和 H2O 各沖洗10 min，兩次實 驗之間和實驗結束后，依次用 20 mmol/L H3PO4 和 H2O 沖洗5 min，毛細管不用時需將兩端水封后置于 4 ℃冰箱中保存。

2 結果與討論 對人工合成的 Ang II 進行純度和穩定性分析。 優化樣品分析所需樣品濃度、電泳緩沖液、樣品溶液 pH 和離子強度等條件，并對樣品的純度進行表征， 對保存溫度和時間對樣品溶液穩定性的影響進行討 論。分別考察了 PHA、 B-Thr、 H-Thr 和 HRP 這 4 種 糖蛋白在毛細管中的吸附性，在電泳中的荷電性質 及遷移，以及保存溫度和時間對 4 種糖蛋白樣品溶 液穩定性的影響。

2． 1 Ang II 分析

2． 1． 1 樣品濃度選擇準確稱取 Ang II 樣品溶于水中，配制成 60 g/L 的母液，實驗時稀釋到所需濃度�？疾鞓悠窛舛扰c 峰面積之間的線性關系，如圖1 所示， Ang II 在0. 03 ～0. 24 g/L 質量濃度范圍內線性關系良好。后續 實驗中所用質量濃度均為 0. 06 g/L，該濃度下樣品 的吸收值可滿足對樣品峰的觀察和對比。圖 2 ( a) 緩沖液種類、 ( b) 硼酸鹽緩沖液的 pH、 ( c) 樣品溶液的 pH 和( d) 樣品溶液中離子強度對分離的影響 Fig． 2 Effects of ( a) buffer type，( b) buffer pH，as well as ( c) pH and ( d) ionic strength of Ang II sample solution on separation

2． 1． 2 電泳緩沖液對分離的影響 電泳緩沖液種類和 pH 是決定分離效果的關鍵 因素之一。實驗中考察了 5 種不同的緩沖體系: 硼 酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、 PBS 緩沖液、磷酸氫二 鈉-檸檬酸緩沖液和檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液( 配比 見表1) 對樣品分析的影響( 如圖2a) 。 不同緩沖體系導致 AngⅡ的遷移差異及負峰的 出現。比較電泳圖中樣品峰的峰高和峰形，發現使 用硼酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、 PBS緩沖液和磷

酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液時，樣品峰的峰形尖銳，峰 高值大。而含有磷酸鹽的后3 者緩沖體系的電流值 明顯高于硼酸鹽緩沖體系，故后續實驗選擇硼酸鹽 緩沖液為電泳緩沖液�？疾炝瞬煌� pH 的緩沖液對

目標峰和雜質峰的靈敏度和分離度的影響( 圖2b) ， 可見pH 為8. 7 和9. 0 時雜質峰的檢測最靈敏，且與 目標峰分離度較好，對目標物的檢測干擾最小，因此 后續實驗選擇 pH 9. 0 的電泳緩沖液。

2． 1． 3 樣品溶液 pH 和離子強度對分離的影響 電泳過程中，待測樣品會在低電導樣品溶液與 高電導電泳緩沖液的界面處發生堆積效應產生富集 作用。當電泳緩沖液保持恒定時，樣品溶液的 pH 和離子強度會對目標峰與雜質峰的分離產生影響。 Moring 等［17］的研究表明，樣品溶液濃度為電泳 緩沖液濃度的1/10 時，樣品的濃縮效果最好。故在 pH 9. 0 硼酸鹽緩沖液( 0. 2 mol/L) 為電泳緩沖液 時，以稀釋的不同 pH 的硼酸鹽緩沖液( 0. 02 mol/L) 配制樣品溶液，考察樣品溶液 pH 值對分離 的影響。結果表明，不同樣品溶液 pH 導致目標峰 面積有所差異，但遷移時間以及目標峰與雜質峰的 分離度基本不變( 圖2c) 。 同樣，樣品溶液中離子強度較低也可使樣品中 組分產生更好的濃縮效果，而增加離子強度則使檢 測靈敏度降低。由圖2d 可見，在相同樣品濃度溶液 中加入 NaCl 時， NaCl 濃度增大使樣品中目標峰和 雜質峰均展寬，且峰面積降低，目標峰與雜質峰的分 離度也降低。說明對樣品進行純度分析時，樣品溶 液中的離子強度或鹽濃度較大不利于提高目標峰和 雜質峰的分離度，實際樣品的純度檢測應在低鹽條 件( ＜50 mmol/L NaCl) 下進行。 綜合考慮上述影響因素，保持目標峰與雜質峰 的分離度最好，且目標峰檢測靈敏度高的優化條件 為:以0. 2 mol/L 硼酸鹽緩沖液( pH 8. 7 或 9. 0) 為 電泳緩沖液，以稀釋 10 倍的電泳緩沖液( 0. 02 mol/L) 配制樣品。 2． 1． 4 樣品的純度分析 考慮到實驗中電滲流和實驗條件的波動對峰面 積值的影響，以目標峰和雜質峰的峰面積及校正的 峰面積( 峰面積/遷移時間) 表示目標峰和雜質峰的 量。利用峰面積歸一化法，分別以目標峰面積與總 峰面積、校正的目標峰面積與總校正峰面積的比值 表示樣品的相對純度。

對0. 06 g/L 的 Ang II 重復測定3 次，測得樣品 的純度值分別為:91. 40% /88. 76%( 峰面積比值/校 正峰面積比值) 、89. 09% /89. 37% 和 90. 83% / 91. 08%。兩種計算方法測得樣品純度的平均值分 別為90. 44%( RSD 1. 09%) 和89. 74%( RSD 1. 09% ) ，兩種方法之間存在約0. 7% 的數值差異，說明本 實驗中的實驗條件穩定，實驗重復性較好。但所測 結果與商品供貨商標示的純度( ≥95%) 有明顯差 異。因供貨商提供的驗證報告結果為 HPLC 分析圖 的峰面積歸一化處理所得，說明毛細管電泳方法與 HPLC 的測定結果表示的純度值存在的差異約在 4. 56%～5. 26%之間。

2． 1． 5 存儲溶液 pH 和存儲溫度對穩定性的影響 使用0. 02 mol/L 的 pH 7. 4 的硼酸鹽緩沖液配 制 Ang II 樣品，將配好的樣品分為3 份，分別置于 20 ℃、 4 ℃和 －20 ℃下保存不同時間。統計各樣品 的目標峰、雜質峰的校正峰面積，比較樣品測定的純 度值變化。

由圖3 可知，溶液狀態的 Ang II 在不同的放置 溫度下，其純度值的變化程度不同，溫度越低，純度 值變化越小。放置溫度為20 ℃時， Ang II 的純度值 下降較快， 24 h 時已降至90%以下。而低溫條件( 4℃和 －20 ℃) 下， Ang II 的純度值變化較小，放置48 h 內，二者均保持在91%以上。4 ℃與 －20 ℃相比， 4 ℃保存時不需對樣品進行反復凍融，使用更方便。 故 Ang II 樣品溶液較好的保存條件為 pH 7. 4 緩沖 液中、 4 ℃下放置，該條件下， Ang II 可在 48 h 內保 持良好穩定性。

2． 2 糖蛋白分析 HRP( 40 kDa) 是植物辣根中存在的糖蛋白酶 類，是酶聯免疫技術中常用的酶之一。凝血酶( 34 kDa) 是由凝血酶原形成的蛋白質水解酶，是凝血過 程中催化血纖蛋白原水解的酶。H-Thr 是通過重組 技術獲得， B-Thr 是從牛血漿中提取而來。PHA ( 115 kDa) 是一類具有特異糖結合活性的糖蛋白， 通過細胞膜上特定的糖基識別可區別細胞的類型和 反映細胞在分化、成熟和腫瘤細胞性變( 性質) 中的 變化，是重要的細胞識別試劑。以上蛋白質都是生 物學中具有重要功能和應用的糖蛋白。

2． 2． 1 糖蛋白的吸附性 蛋白質通常在熔融石英毛細管內壁存在一定的 吸附性，因此考察了 4 種糖蛋白在毛細管內的吸附 性質。結果表明， 4 種糖蛋白在毛細管內壁的吸附 都很強，在電泳過程中幾乎不出峰或峰形嚴重扭曲。 因此選擇可抑制吸附的涂層毛細管進行分析。圖 4 緩沖液 pH 對糖蛋白分離的影響 Fig． 4 Effect of running buffer pH on glycoprotein separation

2． 2． 2 糖蛋白的檢測 因涂層管中的電滲流很弱，故所施電壓主要影 響蛋白質自身的電泳遷移速率。使用硼酸鹽( pH 8. 7) 電泳緩沖液，正向電壓分離時， 40 min 內在負 極檢測端均未檢測到4 種糖蛋白。而采用負向電壓 時，在正極檢測端可檢測到4 種糖蛋白，說明4 種蛋 白質在溶液中均表面帶凈負電荷。由 1. 1 節可知， 所購4 種糖蛋白樣品標示的 pI 值均不是單一值，而 是處于3 ～9 之間。上述實驗結果進一步說明所購

4 種蛋白質的等電點均低于8. 7。此外， H-Thr 和 HRP 電泳時出現單一峰，而 B-Thr 和 PHA 則出現多 重峰，因此認為后兩者可能存在多種蛋白質的亞型 或變體結構。

2． 2． 3 分析條件優化 緩沖液的選擇 考察了硼酸鹽緩沖液( 0. 2 mol/L) 、磷酸鹽緩沖液( 0. 2 mol/L) 和 Tris-HCl 緩沖 液( 0. 1 mol/L) 對分離的影響。Tris-HCl 緩沖液中， H-Thr、 B-Thr 以及 HRP 均不出峰， PHA 多峰間分離 度極差，只出一個包峰; 磷酸鹽緩沖液中， 4 種糖蛋 白分析時基線不平，出峰雜亂，且 B-Thr 和 PHA 的 多峰之間分離度很低; 使用硼酸鹽緩沖液， PHA 和 B-Thr 的多峰間分離度較高，且 H-Thr 和 HRP 的峰 形較好，響應值較高。故實驗中選用硼酸鹽溶液作 為電泳緩沖液。 緩沖液 pH 的選擇 因涂層毛細管的內表面涂 層易受強酸或強堿溶液的破壞，且實驗中 4 種糖蛋 白均沒有確定的等電點，除 HRP 外，其余 3 種蛋白 呈現出5 ～ 8 的等電點范圍，因此，考察了中性 pH 緩沖液( pH 7. 4、 7. 8、 8. 2、 8. 7) 的影響。圖 4 的結 果表明， pH 7. 4 時， 4 種糖蛋白的響應值最低，糖蛋 白 B-Thr 和 PHA 的多峰間分離度也最差;而 pH 8. 7 時， 4 種糖蛋白的出峰較好， B-Thr 以及 PHA 的多峰 得到很好分離，成分單一的 H-Thr 以及 HRP 峰形較 好，且響應值較高。pH 7. 8 和 8. 2 的結果介于二者 之間。因此后續實驗選用 pH 8. 7 的硼酸鹽緩沖液。 分離電壓的選擇 由圖 4 可見， 4 種糖蛋白中 除 HRP 外，其余3 種糖蛋白的峰形明顯較差。為此 考察了電壓對分離的影響。對 H-Thr、HRP 以及 PHA 選擇了 －15，－ 20，－ 25 kV 3 個電壓。因 BThr 出峰數較多，為增加其分辨率，選擇了較低的 －10，－15，－20 kV 3 個電壓。在 － 25 kV 電壓下，蛋白質樣品的遷移時間明顯較快，有利于單一峰 形蛋白質的快速分析( 見圖 5 中 HRP 和 H-Thr) 。 但對含有多峰的 PHA 和 B-Thr 蛋白，隨著電壓的升 高，多峰間的分辨率明顯降低( 見圖 5 中 PHA 和 BThr) 。此外，高電壓下電泳速度加快的同時，蛋白質 樣品的檢測靈敏度有所降低。在 －20 kV 分離時， H-Thr、 HRP 以及 PHA 的分離效果較好，但 B-Thr 的 多峰之間不能有效分離。而在 －10 kV 時， B-Thr 多 峰間的分離得到改善。因此，后續表征蛋白質穩定 性時，對 H-Thr，HRP 以及 PHA 選擇 －20 kV 電壓， 而對 B-Thr 選擇 －10 kV 電壓。

2． 2． 4 糖蛋白的穩定性

將0. 2 mol/L( pH 7. 4) 硼酸鹽緩沖液配制的蛋 白質樣品分為3 份，分別置于 20 ℃、 4 ℃和 －20 ℃ 下放置不同時間。比較樣品的電泳圖變化，圖 6 的 結果顯示， 48 h 內， 3 種保存溫度下， 4 種糖蛋白溶 液的電泳圖沒有明顯改變，說明樣品溶液穩定性良 好。當樣品保存時間大于一周且小于四周，隨著時 間的增加， 3 種溫度對樣品的穩定性存在明顯影響: 在 －20 ℃保存時， 4 種糖蛋白電泳圖相對穩定，峰 形、出峰個數隨時間變化基本不變; 在 4 ℃保存時， H-Thr 的峰形變化較大，難以確定其峰高或峰面積， 但其余3 種糖蛋白的電泳圖基本不變，受保存時間影響不大;在20 ℃保存時，除 HRP 仍基本保持穩定 外，其余3 種糖蛋白的電泳圖均出現明顯變化: HThr 的峰高明顯降低，糖蛋白 B-Thr 和 PHA 的峰形 和峰位置隨時間增加而改變，一些峰降低或消失，但 又有新形態的峰出現。放置時間大于兩周且小于四 周， HRP 仍保持相對穩定，而 H-Thr 的峰幾乎消失; PHA 和 B-Thr 的出峰數、峰高及遷移時間與新配樣 品相比，也出現顯著的變化。

3 結論

多肽和蛋白質等生物樣品的穩定性對后續實驗 研究非常重要。為了保證對多肽和蛋白質等樣品的 定量分析，對其進行高效、快速的穩定性考察和表征 非常必要。本文所用的 Ang II 和4 種糖蛋白的穩定 性均較好，配制的樣品溶液在48 h 內可保持穩定。 毛細管電泳方法具有高效、快速、低成本優勢，適合 用于快速表征和評價多肽和蛋白質樣品的穩定性， 以及研究影響穩定性的關鍵因素，且特別適合價格 昂貴或來源稀少的生物樣品的表征和評價。