色譜法又稱層析法，是利用不同物理化性質的差異而建立起來的技術。所有的色譜系統都由倆個相組成：固定相（固體物質或固定于固體物質上的成分）和流動相（水和其他溶劑）。當待分離的混合物隨流動相通過固體相時，各組分與倆相發生相互作用（吸附，溶解，結合）并因作用力的不同導致流出時間上的差異，分部收集流出液，可以得到樣品中所含的各單一組分，從而達到分離各組分的目的。

色譜層析分離純化蛋白質有多種方法，包括凝膠過濾色譜，離子交換色譜，親和色譜，疏水色譜高效液相色譜等。其中親和色譜在重組蛋白純化中的應用中最為廣泛。分離純化原則總結：應盡可能利用蛋白質不同物理特性選擇所用的分離純化技術，而不是利用相同技術多次純化；不同的蛋白在性質上有很大區別，每一步純化步驟都應當充分利用目的蛋白和雜質成分物理性質差異；在純化早期階段要盡量減少處理體積，方便后續純化；在純化后期階段，再使用造價高的純化方法，有利于純化材料的重復使用，減少再生復雜性。親和色譜親和色譜是利用待分離物質和它的特異性配體間具有的特異性親和力，從而達到分離的目的。即將一對能可逆結合和解離生物分子的一方作為配基，與具有大孔徑、親水性的固相載體相偶聯、制成專一的親和吸附劑并填充色譜柱，使得樣品混合物流經色譜柱時，與親和配基能結合的物質就被選擇性地吸附下來，而其他的蛋白質及雜質不被吸附，從色譜柱中流出，使用適當的緩沖液使被分離物質與配基解吸附，即可獲得純化的目的產物。