原理：等電點聚焦（IEF）是在電場中分離蛋白質技術的一個重要發展，等電聚焦是在穩定的pH梯度中按等電點的不同分離兩性大分子的平衡電泳方法。

在電場中充有兩性載體和抗對流介質，當加上電場后，由于兩性載體移動的結果，在兩極間逐步建立穩定的pH梯度，當蛋白質分子或其他兩性分子存在于這樣的pH梯度中時，這種分子便會由于其表面電荷在此電場中運動，并最終達到一個使其表面靜電荷為0的區帶，這時的pH則是該分子的pI，聚焦在等電點的分子也會不斷擴散，一旦偏離其等電點后，由于pH環境的改變，分子又立即得到正電荷或負電荷，從而又向pI遷移。因此，這些分子總會是處于不斷擴散和抗擴散的平衡中，在pI處得以“聚焦”.

二、儀器與試劑

1．材料：蛋白樣品

2．試劑：

聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、兩性電解質、尿素、NP-40、teiton-100

電極液：1M磷酸（陽極液）、1M氫氧化鈉（陰極液）

固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水楊酸溶于500ml，定容為1000ml

染色液：0.35g考馬斯亮藍R－150溶于300ml脫色液中，加熱到60－70℃，加入0.3g硫酸銅。

脫色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水

樣品緩沖液:1％Ampholine 、2％Triton X-100、9M尿素

三、操作步驟：

1, 樣品制備：

用IEF樣品緩沖液提取待分析樣品，如其他緩沖液提取的樣品則應透析后，冷凍干燥、再復溶于IEF樣品緩沖液。充分溶解后，離心去除不溶雜質。

2,制模具：

洗干凈兩塊IEF專用玻璃板，進行硅化和反硅化處理，兩塊玻璃板的硅化和反硅化面相對，放上夾條，夾子夾好。

3, 配膠：

膠液組成：6ml膠母液（10％，19/1）

6－8％尿素

1ml Ampholine (pH3.5-10)

60-80ul 10%AP

5 ul TEMED

4, 灌膠：配好的膠迅速灌入模具

5, 電泳：

等膠凝固后，小心揭去上下玻璃板，將塑料墊片底部擦干，小心放于電泳槽上。在膠面兩邊各放一根浸透電極緩沖液的電極條。在膠面上任意位置上放上小擦鏡紙片，在紙片上加樣，蓋上蓋子，橫功率25W電泳，約10min后，暫停電泳，取下紙片，繼續電泳約30min，待電流達4mA以下，停止電泳。

6, 表面電極測定蛋白質的pI

7, 固定：取出塑料片，放入固定液中15min

8, 染色：取出塑料片放入染色液中65℃染色，直至條帶出現

9, 可脫色至背景消除后干燥保存。

四、結果 （略）

五、注意事項

1、 兩性電解質是等電聚焦的關鍵試劑，它的含量2�-3�較合適，能形成較好的pH梯度。

2、 丙烯酰胺最好是經過重結晶的。

3、 過硫酸銨一定要新配置。

4、 所有水用重蒸水。

5、 樣品必須無離子，否則電泳時樣品帶可能走歪，拖帶或根本不成帶。