SDS-PAGE電泳的基本原理：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統中引進SDS(十二烷基硫酸鈉)，SDS會與變性的多肽，并使蛋白帶負電荷，由于多肽結合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關，因此SDS多肽復合物在丙稀酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽的大小有關，在達到飽和的狀態下，每克多肽可與1。4g去污劑結合。當分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質的遷移率和分子量的對數呈線性關系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數，若將已知分子量的標準蛋白質的遷移率對分子量對數作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質在相同條件下進行電泳，根據它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量�！ ：配膠緩沖液系統對電泳的影響? A：在SDS-PAGE不連續電泳中，制膠緩沖液使用的是Tris-HCL緩沖系統，濃縮膠是pH6。7，分離膠pH8。9；而電泳緩沖液使用的Tris-甘氨酸緩沖系統。在濃縮膠中，其pH環境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導電性較低的區帶，蛋白分子就介于二者之間泳動。由于導電性與電場強度成反比，這一區帶便形成了較高的電壓剃度，壓著蛋白質分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區帶。當樣品進入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時由于分離膠孔徑的縮小，在電場的作用下，蛋白分子根據其固有的帶電性和分子大小進行分離。所以，pH對整個反應體系的影響是至關重要的，實驗中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應首要考慮該因素�！ ：樣品如何處理? A：根據樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。
1、還原SDS處理：在上樣buffer中加入SDS和DTT(或Beta巰基乙醇)后，蛋白質構象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結合的分子，在電泳中，只根據分子量來分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。
2、帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經久牢固的保護SH基團，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時的紋理現象。100ul樣品緩沖液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。
3、非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測定分子量來使用�！ ：SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用? A：聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺為蛋白質電泳提供載體，其凝固的好壞直接關系到電泳成功與否，與促凝劑及環境密切相關；
制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6。7，分離膠選擇pH8。9，選擇tris-HCL系統，具體作用后面介紹；
TEMED與AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；
十二烷基硫酸鈉(SDS)：陽離子去污劑，作用有四：去蛋白質電荷、解離蛋白質之間的氫鍵、取消蛋白分子內的疏水作用、去多肽折疊�！ ：提高SDS-PAGE電泳分辨率的途徑? A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導致凝固不充分，后者可導致SDS結晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。
2、一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的《蛋白質電泳技術手冊》P82-103�！ ：“微笑”(兩邊翹起中間凹下)形帶原因? A：主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現于較厚的凝膠中。
處理辦法：待其充分凝固再作后續實驗�！ ：“皺眉”(兩邊向下中間鼓起)形帶原因? A：主要出現在蛋白質垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。
處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡�！ ：為什么帶出現拖尾現象? A：主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。
處理辦法：加樣前離心；選擇適當的樣品緩沖液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時間過長，重新配制；降低凝膠濃度�！ ：為什么帶出現紋理現象? A：主要是樣品不溶性顆粒引起的。
處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑�！ ：什么是“鬼帶”，如何處理? A：“鬼帶”就是在跑大分子構象復雜的蛋白質分子時，常會出現在泳道頂端(有時在濃縮膠中)的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質分子重新折疊結合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標條帶大，有時不能進入分離膠。但它卻于目標條帶有相同的免疫學活性，在WB反應中可見其能與目標條帶對應的抗體作用。
處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補充不足的還原劑；或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化�！ ：為什么溴酚藍不能起到指示作用? A：我們在實驗中常會遇到溴酚藍已跑出板底，但蛋白質卻還未跑下來的現象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關。
處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度�！ ：為什么電泳的條帶很粗? A：電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。
處理辦法：適當增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的pH正確(6。7)；適當降低電壓； Q：為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢? A：這種現象一般初學者易出現。比如電壓50v以上，可電流卻在5mA以下。主要是由于電泳槽沒有正確裝配，電流未形成通路。包括：a。內外槽裝反；b。外槽液過少；c。電泳槽底部的絕緣體未去掉(比如倒膠用的橡膠皮)。
處理辦法：電泳槽正確裝配即可�！ ：濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對電泳有影響嗎? A：這主要出現在初學者中，一般對電泳不會有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所致；后者是由于在解除制膠的夾子后，板未壓緊而致空氣進入引起的。
