引物的設計引物最好在模板cDNA的保守區設計，長度15-30bp，GC含量小于60%，3’端不超過連續三個G或C，堿基分布錯落有致，避免引物自身形成二聚體，設計完成之后，需進行BLAST檢測，如果與其他基因不具有互補性，則可以進行下一步實驗。降落PCR降落PCR是一種簡單的降低非特異性產物的PCR，最大的優點就是可以降低實驗耗時，同時又可以優化實驗的步驟。引物的設計決定退火溫度，退火溫度過高會使PCR效率過低，過低則會使非特異擴增過多。這雖然可以通過反復嘗試來優化，但費時費力。降落PCR提供了一個較為簡易的優化方法。首先在較高的溫度下擴增，此時雖然擴增效率低，但非特異擴增基本沒有。隨著退火溫度的降低，非特異擴增會逐步增多。但由于此時特異的擴增產物已經達到一定的數量優勢，因此會對非特異擴增產生強烈的競爭抑制，從而大幅提高PCR的特異性和效率。熱啟動擴增采用熱啟動方法進行擴增，是除了設計最佳引物之外，提高PCR反應特異性最好的方式。在一般的PCR反應中，試劑的配置需在冰上進行，且要將PCR儀預熱，這種方法就類似于熱啟動，能夠一定程度的抑制錯配。但是酶在低溫下也存在活性，只要體系中有DNA鏈存在，就會擴增產生非特異性條帶。采用熱啟動的方法就是在達到變性溫度之前完全抑制酶的活性，而最有效的方法就是使用熱啟動酶或高保真酶去擴增，它的原理就是采用化學修飾的方法封閉酶的活性中心，當溫度上升到95℃時恢復活性，指導擴增。合適的瓊脂糖凝膠的濃度